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你學會細胞傳代的操作步驟了嗎?

原載自:niangtai.cn[技術資料頻道]  2019-09-09  瀏覽次數(shù):6219

                   細胞傳代的操作步驟

細胞傳代是指去除原培養(yǎng)基,將細胞從原培養(yǎng)體系轉移到新鮮的生長培養(yǎng)基中,目的是使細胞得到進一步增殖。依據(jù)細胞是否貼壁生長,又分成貼壁細胞傳代和懸浮細胞傳代。下面分別介紹這2種生長類型的細胞具體傳代步驟。

貼壁細胞傳代
貼壁細胞需要用到一種特定的試劑——蛋白酶,其作用是切斷細胞和容器之間,細胞與細胞之間的相互粘連,用蛋白酶處理細胞的過程叫做“消化”,“消化”之后的下?lián)軙纬蓡渭毎娜萜鞯撞康粝聛?。常用的蛋白酶是胰蛋白酶?/p>

材料準備:

1、預熱培養(yǎng)用液:把已經(jīng)配制好的裝有培養(yǎng)液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴鍋內(nèi)預熱;

2、用75%酒精擦拭經(jīng)過紫外線照射的超凈工作臺和雙手;

3、正確擺放使用的器械:保證足夠的操作空間,不僅便于操作而且減少污染;

4、點燃酒精燈:注意火焰不能太小。

傳代流程:

1. 取出預熱好的培養(yǎng)用液:取出已經(jīng)預熱好的培養(yǎng)用液,用酒精棉球擦拭好后方能放入超凈臺內(nèi)。

2. 從培養(yǎng)箱內(nèi)取出細胞:注意培養(yǎng)瓶取出細胞時要旋緊瓶蓋,用酒精棉球擦拭顯微鏡的臺面,再在鏡下觀察細胞。

3. 將培養(yǎng)瓶放入超凈工作臺后打開瓶口,同時要在酒精燈上燒口消毒。

4. 加入消化液:小心吸出舊培養(yǎng)液,用PBS清洗(沖洗),加入適量消化液(胰蛋白酶液),注意消化液的量以蓋住細胞較好好,消化溫度是37℃。

5. 顯微鏡下觀察細胞:倒置顯微鏡下觀察消化細胞,若胞質回縮,細胞之間不再連接成片,表明此時細胞消化適度。

6. 棄去胰蛋白酶液,加入新鮮的培養(yǎng)液終止反應。小心吹打成細胞懸液。

7. 將細胞懸液吸入10 ml離心管中。平衡后將離心管放入離心機中,以1000 rpm/min離心5 min。

8. 棄去上清液,加入適當體積的培養(yǎng)液,用滴管輕輕吹打細胞制成細胞懸液。

9. 將細胞懸液吸出分裝至2-3個培養(yǎng)瓶中,加入適量培養(yǎng)基旋緊瓶蓋。

10. 顯微鏡下觀察細胞:倒置顯微鏡下觀察細胞量,必要時計數(shù)。注意密度過小會影響傳代細胞的生長,傳代細胞的密度應該不低于5×105/ml。后要做好標記。

11. 繼續(xù)培養(yǎng):用酒精棉球擦拭培養(yǎng)瓶,適當旋松瓶蓋,放入CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。傳代細胞2-4 h后開始貼附在瓶壁上。

2. 懸浮細胞傳代

由于細胞已經(jīng)在生長培養(yǎng)基中懸浮,所以無需酶的作用使其從培養(yǎng)容器表面脫離,方法簡單。通常有兩種方法。

材料準備:

1、裝有懸浮細胞的培養(yǎng)容器。

2、*生長培養(yǎng)基,預熱至37℃

3、37℃培養(yǎng)箱,充有二氧化碳濃度為5%的濕化空氣。

傳代流程:

一、直接傳代法

① 待懸浮細胞長滿至80%~90%(細胞懸液變黃),即可傳代;

② 用吸管吸棄細胞懸液1/2~1/3;

③ 加入適量的新鮮培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)。

二、離心傳代法(在發(fā)現(xiàn)有細胞碎片的情況下)

① 將細胞懸液轉移到離心管內(nèi);

② 150g離心5min,棄去上層清液;

③ 使用新鮮的培養(yǎng)基重懸細胞;

④ 吸管吸取適量細胞懸液,裝入新的培養(yǎng)瓶,再加入適量的新鮮培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)。


 

 

 

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