2019年12月05日國家藥品監(jiān)督管理局醫(yī)療器械技術(shù)審評中心發(fā)布一版《腫瘤相關(guān)突變基因檢測試劑（高通量測序法）性能評價(jià)通用注冊技術(shù)審查指導(dǎo)原則(2019年第83號(hào))》  （以下簡稱“指導(dǎo)原則”），該指導(dǎo)原則是針對腫瘤相關(guān)基因檢測試劑分析性能評價(jià)的一般要求，性能評價(jià)主要思路是：提出產(chǎn)品性能有效性、安全性相關(guān)問題的假設(shè)，然后通過研究進(jìn)行確認(rèn)。

參考品作為性能評價(jià)的主要原材料，可謂是非常重要，文中對此做了詳細(xì)的要求，今天我們就參考品做一些討論。

原文：
4. 參考品要求
內(nèi)部參考品是保證產(chǎn)品性能穩(wěn)定性以及檢測值可溯源的重要構(gòu)成之一。參考品研究應(yīng)包括原料選擇、制備過程、定值研究及評價(jià)指標(biāo)等。申請人應(yīng)對內(nèi)部陽性/陰性參考品的來源、基因序列設(shè)置等信息進(jìn)行驗(yàn)證，并提供參考品溯源過程的測量程序或參考方法的相關(guān)信息及詳細(xì)的驗(yàn)證資料。
具體要求如下：
4.1陽性參考品及陽性質(zhì)控品：
4.1.1陽性參考品
理想狀態(tài)下，陽性參考品應(yīng)當(dāng)包括對所申報(bào)產(chǎn)品每個(gè)基因型的質(zhì)控樣本。但考慮到基于NGS技術(shù)的可檢測基因數(shù)量較多，申請人應(yīng)結(jié)合產(chǎn)品預(yù)期用途、臨床意義及基因類型等因素進(jìn)行針對性和代表性的設(shè)計(jì)。
對于有明確腫瘤伴隨診斷相關(guān)的基因，應(yīng)考慮該類基因參考品設(shè)置的合理性和完整性，需包括伴隨診斷相關(guān)的全部熱點(diǎn)基因，建議采用臨床樣本或細(xì)胞系提取的核酸儲(chǔ)備液作為原料。
對于具有顯著臨床意義或潛在臨床意義的基因，應(yīng)考慮代表性問題，明確具有臨床診斷意義的基因類型及基因型中不同的變異類型。突變頻率、變異類型的選取應(yīng)具有代表性，包括不同外顯子，不同基因變異突變等。
如檢測編碼區(qū)較大且存在非熱點(diǎn)區(qū)域設(shè)計(jì)（如大于1M），建議在陽性參考品中考慮對檢測整體區(qū)域的靈敏度驗(yàn)證（主要關(guān)注SNV等），如混合的永生化正常人白細(xì)胞DNA儲(chǔ)存液等。
不同突變/變異的變異豐度及突變頻率，濃度范圍設(shè)置應(yīng)具有代表性并提供這樣設(shè)定的依據(jù)。陽性參考品的突變形式及拷貝數(shù)需采用有效方法進(jìn)行確認(rèn)，并明確接受標(biāo)準(zhǔn)。申請人在設(shè)計(jì)陽性參考品時(shí)可一并考慮檢測限參考品的設(shè)置及確認(rèn)方式，并提供相關(guān)的依據(jù)。
4.1.2陽性質(zhì)控品
模擬病人樣本的目標(biāo)核酸序列，并用于質(zhì)控整個(gè)檢測過程，包括核酸提?。ㄈ邕m用）、文庫構(gòu)建、測序和數(shù)據(jù)分析。目前陽性質(zhì)控檢測和分析過程應(yīng)與臨床樣本方式一致。
4.2陰性參考品及陰性質(zhì)控品
陰性參考品及陰性質(zhì)控品建議為正常臨床樣本的混合物或細(xì)胞系，應(yīng)明確不含有目標(biāo)區(qū)域腫瘤突變基因。
4.3精密度參考品
精密度參考品設(shè)置要求可參考陽性/陰性參考品。
4.4 PCR 試劑無模板質(zhì)控品（No Template Control，NTC）（如適用）
申請人應(yīng)根據(jù)申報(bào)產(chǎn)品特點(diǎn)設(shè)置NTC質(zhì)控品及檢測接受標(biāo)準(zhǔn)，監(jiān)測檢測過程中是否存在污染。

從原文中可以看出：
1.參考品是必須要的；
2.陽性參考品設(shè)置zui為復(fù)雜，著重聚焦臨床意義的基因位點(diǎn)，不要求全覆蓋，同時(shí)要考慮靈敏度（zui低檢出限LoD）設(shè)置，考慮到濃度梯度或突變梯度的不同，應(yīng)對各水平陽性參考品設(shè)置相應(yīng)檢出要求；
3.陽性質(zhì)控品應(yīng)該匹配整個(gè)檢測過程，檢測和分析應(yīng)該與臨床樣本一致，用于陽性、陰性的判斷；
4.陰性參考品和陰性質(zhì)控品可以為正常臨床樣本或者細(xì)胞系，可以兩者用同一個(gè)；
5.精密度參考品主要用于使用相同的樣本（包括檢測臨界值附近的樣本）在各種特定條件下進(jìn)行檢測（如不同操作員，不同操作條件，不同檢測天數(shù)，不同儀器等），并考慮檢測中主要的變異來源，通過重復(fù)性檢測來評價(jià)性能；
6.NTC主要是用于分析特異性，評估產(chǎn)品僅可檢測到預(yù)期待測變異的能力。

綜上所述，對于參考品的設(shè)計(jì)，我們可以得出如下的表格（本設(shè)計(jì)僅代表小編個(gè)人意見）

按照這個(gè)思路，我們一步一步來設(shè)計(jì)一個(gè)完整的panel。
首先di一步是選擇基因位點(diǎn)，可以按照如下原則來設(shè)計(jì)：
1.如果是一個(gè)小panel，一般設(shè)計(jì)都是針對某一癌種，對應(yīng)的基因都是比較明確，位點(diǎn)能明確的盡量明確，不能明確的盡量涉及多種類型，比如SNV、Insertion、Deletion、Fusion、CNV，更細(xì)分的話，還有frameshift_variant、inframe_deletion、inframe_insertion、missense_variant、Splice_acceptor_Variant、Splice_Donor_Variant、Synonmymous_Variant等等。
因此對應(yīng)的參考品要求覆蓋全基因，位點(diǎn)也盡量全覆蓋，參考品信息可以在科佰生物查詢，如果沒有的位點(diǎn)，可以聯(lián)系科佰生物定制位點(diǎn)。

2.如果是一個(gè)大panel，對于參考品、檢測限、精密度，一般是不可能做到所有基因全覆蓋，并且固定的%AF和CN值的，因此按照《指導(dǎo)原則》的要求，我們應(yīng)該選擇具有臨床意義的基因和位點(diǎn)來表征，*的就是NCCN指南提及的基因，另外再加一些臨床藥物研發(fā)的靶點(diǎn)和biomarker。其中需要特別注意的是由于NGS的探針原理，不能很好的分析出每一種fusion的斷點(diǎn)信息（DNA層面，內(nèi)含子斷點(diǎn)不wei一），因此建議大Panel選擇RNA作為fusion的檢測對象，同樣的也需要選擇RNA作為參考品。

對于大panel的陽性質(zhì)控品選擇，可以選擇泛腫瘤的質(zhì)控品：

如下列舉了常見的重要的基因位點(diǎn)信息，供大家參考，panel的參考品盤可以從中選?。?/span>

（部分截圖）

有了選取的基因和位點(diǎn)，我們開始依次設(shè)計(jì)參考品、質(zhì)控品、檢測限和精密度，

1.陽性參考品盤

1.1根據(jù)目的選擇全盤的基因和位點(diǎn)，比如按照癌種設(shè)計(jì)；
1.2盡量覆蓋所有的基因和位點(diǎn)；
1.3盡量覆蓋SNV、indel、fusion和CNV；
1.4盡量多種突變細(xì)分類型，尤其可以考慮一些內(nèi)含子的剪切變異；
1.5Fusion可以選擇DNA和RNA；
1.6多個(gè)位點(diǎn)要拆包設(shè)計(jì)，不能把臨近甚至相同位點(diǎn)放在一個(gè)包里面；
1.7設(shè)計(jì)的每個(gè)包突變頻率或者CN值固定，這樣利于直接轉(zhuǎn)變?yōu)闄z測限標(biāo)準(zhǔn)品；
1.8不同包之間，盡量互補(bǔ)；
1.9一定要關(guān)注內(nèi)源突變的影響；
1.10如果能兼顧精密度、質(zhì)控盤的設(shè)計(jì)是合適的，這樣能一個(gè)包多種用途。

參考品盤設(shè)計(jì)好之后，就是實(shí)際落地去定制，這其中又涉及倍性、拷貝數(shù)的計(jì)算，還有終檢測的QC標(biāo)準(zhǔn)，一般是選擇DdPCR定標(biāo)，這些工作可以交給科佰生物，我們可以按照客戶的要求定制符合標(biāo)準(zhǔn)的參考盤混合標(biāo)準(zhǔn)品。

2.檢測限參考品
檢測限參考品的設(shè)計(jì)比較簡單，只要將前面定制的參考品盤稀釋到待測的檢測限即可，至于下降到什么標(biāo)準(zhǔn)，依據(jù)平臺(tái)、待測樣本等因素而定，一般靈敏度是早篩>液體活檢>組織檢測。

3.精密度參考品
精密度參考品一般是用于看體系的重復(fù)性，因此取決于實(shí)驗(yàn)室各項(xiàng)的變數(shù)多不多，對于單批次的參考品需要在不同條件下測試，同時(shí)不同批次的參考品也需要在不同條件下測試，尤其是LoD附近的檢測重復(fù)性。
因此如果能做到*把參考品的全部包都能充分驗(yàn)證精密度是佳的，但是這樣的話確實(shí)成本、周期都比較長，折中的選擇是盡量選擇全部的基因，位點(diǎn)可以是一部分，選擇一個(gè)適中的突變頻率或者CN值，再選擇一個(gè)LoD附近的突變頻率或者CN值（當(dāng)然一般建立體系時(shí)還未知LoD的范圍，因此這個(gè)可以后期測試），來做精密度的性能評價(jià)。

4.陽性質(zhì)控品盤
陽性質(zhì)控品盤應(yīng)該匹配整個(gè)檢測過程，檢測和分析應(yīng)該與臨床樣本一致，用于陽性、陰性的判斷。
4.1可以選擇細(xì)胞沉淀、石蠟塊這樣的樣品形式，包含提取的過程；
4.2陽性質(zhì)控品使用頻率高，可以批量制備；
4.3陽性質(zhì)控品用于陽性判斷，因此只要包含所有的基因，不用所有的位點(diǎn)；
4.4陽性質(zhì)控品用于陽性判斷，出于容易檢出的目的，可以設(shè)計(jì)高一些的突變頻率和CN值。

科佰生物推出一款現(xiàn)貨陽性質(zhì)控品盤，包含基因多，突變種類齊全，可以點(diǎn)擊表格查看。

推薦陽性質(zhì)控品盤：

針對大panel的陽性質(zhì)控品，可以考慮泛腫瘤大panel參考品。

5.陰性參考品
陰性參考品建議為正常組織或者細(xì)胞系，只要明確不含有目標(biāo)區(qū)域腫瘤突變基因即可。這里需要提醒的有四點(diǎn)：
5.1陰性參考品用量比較大；
5.2陰性參考品選擇容易制備，而且穩(wěn)定的樣品，穩(wěn)定是指穩(wěn)定供應(yīng)、基因組穩(wěn)定；
5.3陰性參考品的突變驗(yàn)證盡量選擇深度高的NGS或者DdPCR；
5.4陰性參考品還要測對應(yīng)基因的CN值和倍性；

推薦陰性參考品：

6.陰性質(zhì)控品
參照5. 陰性參考品

現(xiàn)在分子診斷技術(shù)日新月異，傳統(tǒng)的PCR、Q-PCR、AMRS-PCR、FISH，一直都被大量用于臨床診斷，到現(xiàn)在如日中天的NGS，越來越得到大家的認(rèn)可，再到下一代的三代測序，讀長長，周期短，便攜，未來預(yù)期美好。技術(shù)的革新給患者帶來新的希望，質(zhì)量保障是希望的前提，參考品盤是質(zhì)量檢測有力的工具。

我們呼吁業(yè)內(nèi)的每一家單位的每一個(gè)檢測，都能用上參考品，對我們每一份發(fā)出的數(shù)據(jù)都能負(fù)責(zé)。