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細(xì)胞株的篩選實(shí)驗(yàn)原理解析

原載自:www.niangtai.cn[行情動態(tài)]  2019-05-08  瀏覽次數(shù):2873

   細(xì)胞株的篩選實(shí)驗(yàn)原理解析
  細(xì)胞株購買就選科佰!外源基因在細(xì)胞中的表達(dá)可分為兩大類,一類是瞬時表達(dá),一類是穩(wěn)定表達(dá)。前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色體中,雖然可以達(dá)到高水平的表達(dá),但通常只持續(xù)幾天。后者外源DNA整合到宿主細(xì)胞染色體上,使宿主細(xì)胞可長期表達(dá)目的基因。建立穩(wěn)定細(xì)胞株,一般是根據(jù)不同基因載體中所含有的抗性標(biāo)志選用相應(yīng)的藥物對靶細(xì)胞進(jìn)行篩選。常用的抗性標(biāo)記基因有潮霉素(hygromycin)、新霉素(neomycin)和嘌呤霉素(puromycin),常用Hygromycin B、G418和puromycin進(jìn)行選擇性篩選。傳統(tǒng)的穩(wěn)定株篩選方法需要通過外源基因的瞬時轉(zhuǎn)染后對靶細(xì)胞進(jìn)行篩選,終獲得從單一細(xì)胞擴(kuò)增起來的穩(wěn)定細(xì)胞株,該方法陽性率低,周期長,工作量大。慢病毒是一種RNA病毒,攜帶的外源基因在病毒感染細(xì)胞后需要逆轉(zhuǎn)錄為DNA,再整合到宿主細(xì)胞基因組以后才能表達(dá)。利用慢病毒必須整合到宿主基因組的特性來篩選穩(wěn)定株的方法克服了傳統(tǒng)方法的弊端,可以在短時間內(nèi)獲得率的穩(wěn)定細(xì)胞株。篩選得到的細(xì)胞或者可穩(wěn)定表達(dá)目的蛋白,用于蛋白的擴(kuò)增和富集;或者得到穩(wěn)定沉默特定基因的細(xì)胞株。
  篩選穩(wěn)定細(xì)胞株時出現(xiàn)的問題及其解決辦法:
  做hela細(xì)胞的篩選,現(xiàn)在已經(jīng)篩選穩(wěn)定細(xì)胞株3周,在6孔板中已經(jīng)長出一些細(xì)胞簇,想把它挑到96孔板中,就用2ul胰酶消化,在消化過程中,胰酶擴(kuò)散,細(xì)胞已經(jīng)四散開,和周圍的其它細(xì)胞簇融合在一起(我的細(xì)胞簇離的很近),就是說幾個細(xì)胞簇被胰酶融合在一起,那樣根本沒有辦法做下去了,該怎么辦?
  1.可以減少胰酶量;胰酶在加入之前要用37度溫箱預(yù)熱,并且PBS潤洗細(xì)胞層,以減少可能殘存的血清的影響;
  2.加入胰酶后,稍過幾秒鐘就可以吸走消化液了,不用吸干凈,然后放到37度溫箱中繼續(xù)作用1MIN,這時,消化酶可以繼續(xù)作用的,又可避免胰酶擴(kuò)散;
  3.顯微鏡下觀察細(xì)胞*松散開,就可以在局部加培養(yǎng)基,并被吸走了;
  4.具體消化的時間,注意摸索,如果在步驟b中顯微鏡下見細(xì)胞尚未*松散開,可以再重復(fù)的,直到松散開,能夠被吸走為止。
  建議:
  1.在100mm dish中挑克隆,細(xì)胞分的稀一點(diǎn)。
  2.把細(xì)胞全部消化下來,在96孔板中逐步稀釋篩選穩(wěn)定細(xì)胞株。

 

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