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細(xì)胞株建株要點(diǎn)及過(guò)程實(shí)例分析
原載自:www.niangtai.cn[行情動(dòng)態(tài)] 2019-11-15 瀏覽次數(shù):1083
細(xì)胞株建株要點(diǎn)及過(guò)程實(shí)例分析
細(xì)胞株通過(guò)選擇法或克隆形成法從原代培養(yǎng)物或細(xì)胞系中獲得具有特殊性質(zhì)或標(biāo)志物稱(chēng)為細(xì)胞株。細(xì)胞株的特殊性質(zhì)或標(biāo)志必須在整個(gè)培養(yǎng)期間始終存在。如果不能繼續(xù)傳代或傳代數(shù)有限,稱(chēng)為有限細(xì)胞株;如果可以連續(xù)傳代,稱(chēng)為連續(xù)細(xì)胞株。對(duì)于人類(lèi)腫瘤細(xì)胞,在體外培養(yǎng)半年以上,生長(zhǎng)穩(wěn)定,并連續(xù)傳代的即可稱(chēng)為連續(xù)性株或系。
細(xì)胞株的建株實(shí)例講解:
一、腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)要點(diǎn)
1.取材:材料主要來(lái)源于外科手術(shù)或活檢瘤組織,取材時(shí)避免用壞死組織,要挑選瘤細(xì)胞集中和活力較好的部位,瘤性轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)或胸腹水是較好的培養(yǎng)材料。取材后盡快培養(yǎng),因故不能立即培養(yǎng)者,可凍存。其培養(yǎng)方法及凍存方法同前述正常組織。
2.成纖維細(xì)胞排除:在腫瘤組織中?;祀s有一些成纖維細(xì)胞,培養(yǎng)時(shí)能與瘤細(xì)胞同時(shí)生長(zhǎng),并常壓過(guò)癌細(xì)胞,導(dǎo)致癌細(xì)胞生長(zhǎng)受阻以至消失,應(yīng)仔細(xì)排除。
排除方法常有:機(jī)械刮除法、反復(fù)貼壁法、消化排除法、膠原酶消化法等。
3.提高腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)存活率和生長(zhǎng)率
根據(jù)實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn),腫瘤細(xì)胞在體外不易培養(yǎng),建立能傳代的腫瘤細(xì)胞系更為困難。一般當(dāng)腫瘤組成或細(xì)胞被原代培養(yǎng)后,要經(jīng)過(guò)對(duì)新環(huán)境的適應(yīng)才能生長(zhǎng),因此不能局限于一般培養(yǎng)法,須采用一些特殊措施。如用適宜底物,鼠尾膠原底層及飼細(xì)胞底層等。用細(xì)胞生長(zhǎng)因子,根據(jù)細(xì)胞種類(lèi)不同選用不同的促細(xì)胞生長(zhǎng)因子,如胰島素、雌激素等。也可以考慮動(dòng)物媒介培養(yǎng)。
二、人類(lèi)淋巴母細(xì)胞建株方法
1.取4ml肝素抗凝血于離心管中,加入2ml RPMI 1640。
2.混勻后沿管壁緩慢加到預(yù)置有4ml淋巴細(xì)胞分離液的液面上靜置30min。
3.1500rpm,15min,吸取白細(xì)胞層于另一離心管中。
4.加RPMI 1640 5ml洗滌白細(xì)胞兩次。
5.將白細(xì)胞接種至1ml RPMI 1640培養(yǎng)基中,加入10μl環(huán)胞霉素和100μl的EB(EB病毒)液,混勻。
6.水浴搖床,40次/分,37℃,3hr。
7.1500rpm,15min。將細(xì)胞接種至1ml培養(yǎng)基中(內(nèi)含谷氨酰胺1mM/ml)加入10μl環(huán)胞霉素,輕輕混勻,37℃培養(yǎng)。
8.五天后觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)化和生長(zhǎng)情況,決定是否半量換液。一般半量換液1-2次,并維持環(huán)胞霉素的濃度。
9.待轉(zhuǎn)化細(xì)胞數(shù)量明顯上升,并出現(xiàn)細(xì)胞團(tuán)塊后,可轉(zhuǎn)入25ml細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,加1-2ml培養(yǎng)基,37℃培養(yǎng)10-15天,一般每隔3-4天觀察一次,決定是否換液,傳代。
10.細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)一定數(shù)量后凍存,凍存前應(yīng)進(jìn)行核型分析和存檔。